ほとんどのウイルスのゲノム配列は知られています。相補的なウイルス DNA または RNA セグメントとハイブリダイズするように設計された DNA の短いセグメントである核酸プローブ。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は、ウイルス検出のためのより効率的な手法です。最近、ハイスループット診断法が開発されました。
A. 核酸ハイブリダイゼーション技術
主にサザンブロッティング（サザン）とノーザンブロッティング（ノーザン）を含む核酸ハイブリダイゼーションは、ウイルス診断分野で急速に発展している新しい技術です。ハイブリダイゼーション アッセイの理論的根拠は、相補的なウイルス DNA または RNA セグメントとハイブリダイズするように設計された DNA の短いセグメント (「プローブ」と呼ばれる) を使用することです。二本鎖の標的DNAまたはRNAを加熱またはアルカリ処理により一本鎖に分離し、固体担体に固定化します。その後、プローブを添加し、標的DNAまたはRNAとハイブリダイズさせます。プローブは同位体または非放射性核種で標識されているため、ターゲット DNA または RNA は、オートラジオグラフィーまたはビオチン-アビジン システムによって検出できます。ほとんどのウイルスゲノムはクローン化および配列決定されているため、検体中のプローブとしてウイルス特異的配列を使用して検出できます。現在、ハイブリダイゼーションの方法には、ドットブロット、細胞内 in situ ハイブリダイゼーション、DNA ブロット（DNA）（サザンブロット）、RNA ブロット（RNA）（ノーザンブロット）があります。
B.PCR技術
近年、感受性のない、または培養不可能なウイルスを検査するために、一連の in vitro 核酸増幅技術が PCR に基づいて開発されました。PCR は、in vitro ポリメラーゼ反応により特定の DNA 配列を合成できる方法です。PCR のプロセスには、変性、アニーリング、および伸長の 3 つのステップのサーマル サイクルが含まれます。次に、低温 (37℃~60℃) で、合成された 2 つのヌクレオチドプライマーが相補的な DNA セグメントにアニールします。一方、Taq 酵素に適した温度 (72℃) では、プライマーの 3' 末端から、相補的な DNA を鋳型とし、単一ヌクレオチドを材料として、新しい DNA 鎖の合成が開始されます。したがって、各サイクルの後、1 本の DNA 鎖を 2 本の鎖に増幅できます。このプロセスを繰り返すと、1 つのサイクルで合成された各 DNA 鎖は次のサイクルのテンプレートとして使用でき、DNA 鎖の数は各サイクルで 2 倍になります。つまり、PCR の生成物は 2n log の速度で増幅されます。25 ～ 30 サイクル後、電気泳動により PCR の生成が確認され、特定の DNA 産物が UV 光 (254nm) で観察されます。PCR は、その特異性、感度、および利便性の利点から、HCV、HIV、CMV、および HPV などの多くのウイルス感染症の臨床診断に採用されています。PCR は非常に感度が高く、ウイルス DNA を fg レベルで検出できるため、誤検出を避けるために操作は慎重に行う必要があります。また、核酸検査での陽性結果は、検体中に生きた感染性ウイルスが存在することを意味するものではありません。
PCR技術の幅広い応用により、さまざまな検査目的のためにPCR技術に基づいて新しい技術と方法が開発されています。たとえば、リアルタイム定量的 PCR はウイルス量を検出できます。in situ PCR は、組織または細胞のウイルス感染を識別するために使用されます。ネストされた PCR は、PCR の特異性を高めることができます。その中で、リアルタイム定量的 PCR はより急速に開発されました。TaqMan 加水分解プローブ、ハイブリダイゼーション プローブ、分子ビーコン プローブなどの多くの新しい技術は、臨床研究で広く利用されているリアルタイム定量的 PCR 技術に組み合わされています。この方法は、患者の体液中のウイルス量を正確に特定するだけでなく、薬剤耐性変異体の検出にも使用できます。したがって、リアルタイム定量的 PCR は、主に治療効果の評価と薬剤耐性の監視に適用されます。
C. ウイルス核酸のハイスループット検出
新しい緊急感染症の迅速な診断のニーズを満たすために、DNA チップ (DNA) のようなさまざまなハイスループット検出方法が確立されています。DNA チップの場合、特定のプローブが合成され、非常に高密度で小さなシリコン チップに結合されて、サンプルとハイブリダイズできる DNA プローブ マイクロ アレイ (DNA) が形成されます。ハイブリダイゼーションのシグナルは、共焦点顕微鏡やレーザー スキャナーで画像化でき、コンピューターでさらに処理することで、さまざまな遺伝子に関する膨大なデータ セットを取得できます。DNAチップには2種類あります。「合成チップ」は次のとおりです。特定のオリゴヌクレオチドがチップ上で直接合成されます。もう1つはDNAプールチップです。クローン化された遺伝子または PCR 産物は、スライド上に整然と印刷されます。DNA チップ技術の利点は、膨大な量の DNA 配列を同時に検出できることです。病原体検出チップの最新バージョンは、一度に 1700 を超えるヒト ウイルスを識別できます。DNA チップ技術は、従来の核酸ハイブリダイゼーション法の問題を解決し、ウイルス診断や疫学研究に非常に幅広い用途を持っています。
投稿時間: Dec-23-2020